Лабораторные исследования животных. Методы проведения

Заведующая диагностическим отделом
городской ветеринарной лаборатории
Рощина Р.В.

  • Метод иммунофлуоресценции

  • Метод подавления иммунофлуоресценции

  • Окраска по Муромцеву

  • Окраска по Селлерсу




  • Метод иммунофлуоресценции

    Реакция иммунофлуоресценции применяется для экспресс-диагностики многих заболеваний, в частности бешенства. Сущность метода: мазки-отпечатки головного мозга обрабатываются флюоресцирующим глобулином, содержащим связанные с люминесцентной краской антитела к вирусу бешенства . Если головной мозг поражен вирусом бешенства, то антитела связываются с антигеном вируса бешенства и образовавшийся комплекс антиген-антитело-люминесцентная краска имеет специфическое свечение.

    Из каждого отдела головного мозга (аммонова рога, мозжечка, коры больших полушарий и продолговатого мозга) готовят по два препарата - мазка-отпечатка.

    Не допускаются для исследования пробы, консервированные глицерином, фиксированные этиловым спиртом, формалином и другими средствами, вызывающими денатурацию и разрушение антигенов или создающими дополнительный ("свой") фон свечения.

    1. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при плюс 4 или минус 12 С в течение 4-12 часов. Затем препараты извлекают из ацетона, высушивают на воздухе 10-15 минут и помещают их во влажную камеру (чашки Петри с увлажненным дном).
    2. Диагностический антирабический флуоресцирующий иммуноглобулин (ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно на всю поверхность препарата при помощи пипетки (примерно 0,1мл на один препарат), закрывают камеру с препаратами, помещают в термостат и выдерживают 30 минут при 37 С. Затем предметные стекла с препаратом троекратно промывают, погружая их каждый раз на 10 минут в сосуд, наполненный фосфатным буфером рН 7,4 , помывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. На окрашенные препараты наносят иммерсионное нефлуоресцирующее масло.
    3. Подготовленне препараты просматирвают под люминесцентным микроскопом с иммерсионной системой.
    4. При положительных результатах исследования в препаратах, содержащих антиген бешенства, обнаруживают разной величины и формы ярко светящиеся желто-зеленым светом гранулы в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется от едва заметных в виде песчинок образований до 15-20 мм.
      Не пораженная вирусом бешенства мозговая нервная ткань светится тусклым серовато-желтым или зеленоватым светом.

    Метод подавления иммунофлуоресценции

    Сущность метода заключается в способности рабического антигена, связанного с нефлуоресцирующими антителами, вторично не входить в соединение с флуоресцирующим специфическим конъюгатом. Это свойство используется для доказательства специфичности свечения комплекса "антиген-антитело" при исследовании препаратов, предварительно не обрабатываемых нефлуоресцирующими антителами.

    1. На фиксированные препараты, приготовленные из исследуемых участков головного мозга, наносят пипеткой 5% антирабический нефлуоресцирующий моноспецифический иммуноглобулин, выдерживают их в течение 30 мин во влажной камере в термостате при 37С. Затем преператы промывают двукратно нейтральным физиологическим раствором и окрашивают ДАФИ.
    2. Препараты просматривают под люминесцентным микроскопом с иммерсионной системой.
    3. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, предварительно обработанных нефлуоресцирующим, а затем флуоресцирующим иммуноглобулином, свечения не должно быть, а в препаратах, ранее обработанных только флуоресцирующим иммуноглобулином наблюдают специфическое свечение.

    Окраска по Муромцеву

    1. Влажные мазки фиксируют этиловым или метиловым спиртом, или спирт-эфиром поровну, или ацетоном в течение 1-2 часов.
    2. Промывают дистиллированной водой.
    3. Красят 5-10 минут синькой Мансона в разведении 1:40.
    4. Сливают краску.
    5. Дифференцируют 10% водным раствором танина 8-10 минут (до появления голубоватой окраски).
    6. Промывают водой.
    7. Высушивают фильтровальной бумагой.

    Окрашенный мазок имеет светло-голубой фон, при этом ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, а тельца Бабеша-Негри – в бледно-фиолетовый с темными включениями.

    Окраска по Селлерсу

    На приготовленный влажный мазок наносят (4-5 сек) смесь реактива А (метиленовый синий – 2г, метиловый спирт без ацетона – 100 мл) и реактива В (основной фуксин 0,5 г, этиловый спирт без ацетона 100 мл).

    Рабочий раствор красителя состоит из 25 мл метилового спирта, 15 мл реактива А, 2-4 мл реактива В. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают.

    В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша-Негри – с отчетливой базофильной структурой.

    Заведующая диагностическим отделом
    городской ветеринарной лаборатории
    Рощина Р.В.

    [ начало ]

    Переход: [главная страница]  [ветеринария]



    Украинская баннерная сеть

    Система обмена баннерами

    Использование материала со страниц сайта в коммерческих целях только по согласованию с авторами.
    При использовании информации в некоммерческих целях - обязательно указание автора и источник получения материала.
    Поставьте ссылку на наш сайт.
    © AKcON 1999